西湖大學(xué)謝琦等，基于計算蛋白質(zhì)設(shè)計的方法從頭設(shè)計并篩選得到了針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表面的高表達(dá)的腫瘤抗原EGFR和CD276兩個靶點(diǎn)高親和力的迷你結(jié)合蛋白（Binder）CAR結(jié)構(gòu)，同現(xiàn)階段臨床試驗(yàn)中的相同靶點(diǎn)的scFv CAR結(jié)構(gòu)相比較，在臨床前模型中Binder CAR顯著提高了CAR T療法對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果。（Nat Biomed Eng. 2024年10月17日在線版）

CAR-T是新型腫瘤免疫療法，通過基因工程改造患者T細(xì)胞，利用CAR結(jié)構(gòu)的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別腫瘤細(xì)胞表面抗原并通過胞內(nèi)信號域激活T細(xì)胞，有效地識別并攻擊腫瘤細(xì)胞。CAR在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療領(lǐng)域已取得巨大成功，國內(nèi)外已有多款針對血液腫瘤的CAR T藥物上市。

CAR T療法對包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的諸多實(shí)體瘤效果卻十分有限。為進(jìn)一步提升CAR T細(xì)胞在治療實(shí)體瘤時的療效，當(dāng)前多數(shù)研究致力于改良CAR T細(xì)胞內(nèi)的共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或通過基因編輯系統(tǒng)重編程細(xì)胞狀態(tài)，以達(dá)到提升其治療實(shí)體瘤時的療效的目的。

作為腫瘤細(xì)胞特異性識別的核心部件，CAR T細(xì)胞的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，基本上沿用初代CAR T采用單鏈抗體的設(shè)計。然而，scFv由單克隆抗體的輕鏈（VL）和重鏈（VH）通過Linker連接而成，因此單鏈抗體的重、輕鏈易發(fā)生錯誤聚集和折疊，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，不僅影響了T細(xì)胞識別抗原細(xì)胞能力，還可引起非抗原依賴性的T細(xì)胞激活，導(dǎo)致T細(xì)胞的過早耗竭，極大降低了CAR-T療法治療效果。開發(fā)不依賴于傳統(tǒng)單鏈抗體的CAR T抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新策略，可能為提高CAR T細(xì)胞治療實(shí)體瘤療效開辟蹊徑。

研究者開發(fā)了一套使用Binder代替?zhèn)鹘y(tǒng)scFv作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新型CAR構(gòu)建策略，用于有效識別腫瘤表面抗原，并提高CAR T療法對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果。該策略從已知癌癥靶標(biāo)的蛋白結(jié)構(gòu)入手，選擇合適的靶蛋白表面，并利用游離氨基酸匹配和空間匹配算法獲得與該表面契合的Binder空間位置，使用Rosetta平臺，通過能量打分函數(shù)對Binder的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計，并進(jìn)行多輪迭代優(yōu)化，得到了對于腫瘤靶標(biāo)具有良好的穩(wěn)定性和良好的識別結(jié)合能力的Binder蛋白（約55~60個氨基酸）。再將優(yōu)化完成的Binder蛋白與二代CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行組裝，并在體內(nèi)體外多層次驗(yàn)證其生物學(xué)功能。

研究者首先從已報道的EGFR binder入手，用于驗(yàn)證Binder CAR T該項(xiàng)設(shè)計的可行性。他們嘗試將EGFR binder整合入具有4-1BB或是CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的二代CAR結(jié)構(gòu)中，同時采用現(xiàn)階段臨床試驗(yàn)進(jìn)行中的相同靶點(diǎn)的EGFR scFv結(jié)構(gòu)也用相似的策略構(gòu)建產(chǎn)生scFv CAR作為實(shí)驗(yàn)對照。

研究者對Binder CAR T的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)性的功能分析，包括在CAR T細(xì)胞在體外與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原代腫瘤細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系中評估Binder CAR T與傳統(tǒng)scFv CAR T腫瘤殺傷，細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性細(xì)胞因子分泌和T細(xì)胞耗竭以及轉(zhuǎn)錄組水平變化等多個指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR binder CAR T細(xì)胞在所有這些方面的表現(xiàn)都明顯優(yōu)于EGFR scFv CAR T細(xì)胞，其在面對高負(fù)荷的腫瘤壓力的情況下，Binder CAR T維持了更高的腫瘤殺傷能力，更高的細(xì)胞因子分泌水平以及較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力，并且在腫瘤負(fù)荷下表現(xiàn)出較低的腫瘤耗竭指標(biāo)的表達(dá)。

而在小鼠原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植模型以及免疫健全小鼠模型中，EGFR binder CAR T細(xì)胞相較于傳統(tǒng)EGFR scFv抑制了腫瘤生長，顯著延長了小鼠的存活時間，顯示卓越的抗腫瘤功效，且無明顯的毒副作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Binder CAR T設(shè)計策略的是否具備有廣譜的適用性，研究者沿用相同策略，從頭設(shè)計了一種專門針對另一種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抗原CD276的binder CAR T。與CD276 scFv CAR T細(xì)胞相比，工程改造的CD276 binder CAR T細(xì)胞也在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出卓越的腫瘤殺傷能力，這表明Binder CAR T策略對不同靶點(diǎn)均具有可行性。

該研究開發(fā)了基于蛋白質(zhì)從頭設(shè)計技術(shù)的Binder蛋白替代傳統(tǒng)的scFv作為CAR T抗原結(jié)合域的新策略，在臨床前模型中展示出了優(yōu)異的抗腫瘤效果?；诖?，在西湖大學(xué)和西湖實(shí)驗(yàn)室的大力支持下，研究者和臨床醫(yī)院合作，正在開展基于CD276 binder CAR T治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)，有望為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供新助力。

（編譯 張俊熙）