2020年度諾貝爾化學(xué)獎頒給在CRISPR基因編輯領(lǐng)域做出卓越貢獻的現(xiàn)在德國工作的法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier教授和美國加州大學(xué)Jennifer Doudna教授，表彰她們發(fā)明基因修飾方法CRISPR-Cas9，CRISPR基因編輯這一革命性發(fā)現(xiàn)為整個生物技術(shù)領(lǐng)域提供了無限可能。

CRISPR技術(shù)的故事

30年前，一位名為Francisco Mojica的年輕人在一座名為圣波拉(Santa Pola)的地中海小城一所大學(xué)開始攻讀博士學(xué)位，他的研究對象就是圣波拉海灘上發(fā)現(xiàn)的一種古細菌。

在分析這種古細菌的DNA序列時，年輕的Mojica觀察到了一個有趣的現(xiàn)象——這些微生物的基因組里，存在許多奇怪的“回文”片段。這些片段長30個堿基，且會不斷重復(fù)。在兩段重復(fù)之間，則是長約36個堿基的間隔。對于這種具有規(guī)律性的重復(fù)，Mojica將其命名“常間回文重復(fù)序列簇集”(Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats。，縮寫就是CRISPR)。

事實上，這并非人類首次發(fā)現(xiàn)CRISPR序列。早在1987年，日本研究者(石野良純教授為第一作者)就已發(fā)表論文，表明大腸桿菌里也有類似的序列。不少學(xué)者認為，這是人類首次知道CRISPR序列的存在。日本團隊當(dāng)時并未對CRISPR序列進行詳細研究，因此其功能還不為人知。

Mojica教授推斷，如果兩種有著巨大差異的微生物里都有這種奇怪的序列，這就說明它肯定有著某種特殊的功能。后來，他又發(fā)現(xiàn)大約另外20多種微生物里，同樣具有CRISPR序列。這種奇怪序列的功能，卻遲遲未能得到解答。

為了尋找CRISPR序列的功能，Mojica每天都在數(shù)據(jù)庫里搜索，想發(fā)現(xiàn)這些奇怪序列的意義。2003年，Mojica發(fā)現(xiàn)，一些大腸桿菌內(nèi)的CRISPR序列，與一種叫做“P1噬菌體”的病毒的序列高度吻合，這種噬菌體能攻擊大腸桿菌，但這批大腸桿菌竟完全不受P1噬菌體的感染。這與人類免疫系統(tǒng)相似，免疫系統(tǒng)記住過去遇到過的病原體模樣，病原體入侵人體后，免疫系統(tǒng)會對其進行攻擊，大腸桿菌細胞內(nèi)，CRISPR序列也能讓細菌記住噬菌體的模樣，抵抗病毒感染。

Mojica的研究論文在《自然》、《美國國家科學(xué)院院報》、Molecular Microbiology和Nucleic Acid Research等雜志拒稿后，發(fā)表在Journal of Molecular Evolution(影響因子不到2分)雜志上。

接下來的幾年里，研究者們對CRISPR序列的作用做了進一步的完善，并闡明了詳細機理。在病毒感染細菌后，CRISPR序列會喊來幫手，形成一個具有核酸切割能力的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，最終切斷病毒的DNA。對于細菌來說，這是從源頭清除病毒感染的好方法。

這套細菌的“免疫系統(tǒng)”讓生物學(xué)家看到了精準(zhǔn)切割DNA的希望，或許可以藉此開發(fā)一種高效的基因編輯方法。

2012年，奧地利Emmanuelle Charpentier教授與美國加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna教授在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了她們的發(fā)現(xiàn)，她們所設(shè)計的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)(Cas9是一種能切割DNA的內(nèi)切酶)能在DNA的特定部位“定點”切割，認為將來或可利用這個系統(tǒng)對基因組進行編輯。

在立陶宛，一名叫做Virginijus Siksnys的科學(xué)家也在研究使用CRISPR系統(tǒng)編輯基因的潛力。雖然他的論文投的時間更早，但不幸被《細胞》雜志編輯拒稿，只能轉(zhuǎn)投《美國國家科學(xué)院院報》，使得他的論文最終要晚2個月上線。

2013年初，《科學(xué)》雜志再度刊登了一篇關(guān)于CRISPR系統(tǒng)的重磅文章。主導(dǎo)這項研究的是美國Broad研究所的張鋒教授。研究者首次將CRISPR技術(shù)應(yīng)用到了哺乳動物細胞內(nèi)，并證明它能在短短幾周之內(nèi)，建立起小鼠的疾病模型。該團隊也首次在人類細胞中成功使用CRISPR-Cas系統(tǒng)完成了基因編輯。

自CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)誕生以來，科學(xué)家們對其進行了大量的優(yōu)化與改造。一方面，現(xiàn)在的CRISPR基因編輯技術(shù)可以變得更精準(zhǔn)，帶來更少的脫靶效應(yīng)(指修改了不應(yīng)修改的基因);另一方面，CRISPR系統(tǒng)也已經(jīng)超越了DNA，能對RNA進行有效編輯。

初代的CRISPR技術(shù)涉及DNA雙鏈的斷裂，會引起潛在的風(fēng)險。如今，科學(xué)家們基于CRISPR體系，已經(jīng)開發(fā)出了“單堿基”基因編輯系統(tǒng)，能對基因進行“微調(diào)”，這種“單堿基”基因編輯系統(tǒng)有著更高的精度。

CRISPR技術(shù)三巨頭專利之爭

自CRISPR技術(shù)問世以來，就一直被諾獎候選的光環(huán)所環(huán)繞，人們雖然確信CRISPR基因編輯技術(shù)遲早會得諾獎，但哪幾位科學(xué)家能最終獲獎，大家看法也不同。有關(guān)CRISPR基因編輯技術(shù)的專利也一直是個熱議的問題，迄今也未得到完美解決。

2012年8月17日， Jennifer Doudna和Emmanulle Charpentier合作，在 Science 雜志發(fā)表了基因編輯史上的里程碑論文，成功解析了CRISPR/Cas9基因編輯的工作原理。2013年2月15日， 張鋒在 Science 雜志發(fā)表了， 首次將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于哺乳動物和人類細胞。自此，近年來生命科學(xué)領(lǐng)域最耀眼的技術(shù)正式宣告誕生，Jennifer Doudna、Emmanulle Charpentier、張鋒三人，也被人們稱為 CRISPR基因編輯三巨頭。

三巨頭在CRISPR基因編輯領(lǐng)域接連取得重要進展，發(fā)表了大量重磅論文。由于CRISPR基因編輯技術(shù)在疾病治療、疾病檢測、遺傳育種等領(lǐng)域有著巨大優(yōu)勢和前景，三巨頭分別成立公司，開始CRISPR基因編輯的商業(yè)化應(yīng)用。如今三家公司均在CRISPR基因編輯治療遺傳病領(lǐng)域取得了許多突破，張鋒的Editas Medicine已開始基因編輯治療先天性黑蒙癥10型的臨床試驗，另外兩家公司也在治療某些罕見遺傳病的臨床試驗中取得進展。

為了CRISPR的專利歸屬權(quán)，Doudna和Charpentier曾與華裔科學(xué)家張鋒對簿公堂。雖然Doudna在2012年5月25日就提交了保護CRISPR技術(shù)的專利申請，但七個月后提交專利申請的張鋒卻先拿到了專利授權(quán)。2014年4月15日，美國專利局將CRISPR-Cas9技術(shù)的專利頒發(fā)給張鋒所在的Broad研究所。2016年1月，加州大學(xué)相關(guān)組織要求對Broad研究所的最早專利以及另外多項專利進行專利干涉，這個請求很快得到了相關(guān)部門的受理。不過經(jīng)過一系列的專利爭奪戰(zhàn)之后，美國專利局在2017年2月15日判定：CRISPR關(guān)鍵專利仍然歸張鋒團隊所有。

張鋒是華人生物學(xué)界最耀眼的新星，風(fēng)投競相追逐的對象，諾貝爾獎的大熱門。2013年，張鋒發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)可用來編輯DNA，使基因療法成為可能，獲得美國瓦利基金青年研究家獎，2014年被《Nature》雜志評為2013年度十大科學(xué)人物，獲得一系列最高榮譽，獲得美國首個CRISPR專利后，宣布對學(xué)術(shù)界開放CRISPR/Cas9基因編輯的專利，只要研究不是出于商業(yè)目的，就可以隨意免費地使用。不僅如此，他還把自己的研究資源放到公共庫Addgene中，免費分發(fā)于天下。自CRISPR/Cas9發(fā)明以來，其一半重大突破都出自張鋒之手。

至于到底誰才最應(yīng)該擁有CRISPR基因編輯發(fā)明人及榮譽和利益，學(xué)界的普遍看法是，Charpentier和Doudna推動了CRISPR編輯的發(fā)展，張鋒則是通過證實它能在真核細胞中起作用而揭示了它的巨大潛力，來自哈佛醫(yī)學(xué)院的George Church則又獨立證實了張鋒的這一研究發(fā)現(xiàn)。

張鋒曾提供他的實驗室詳細實驗記錄，明確記錄著他早在其他兩位科學(xué)家論文發(fā)表之前就走在了他們的研究進度前，他在2012年年初就創(chuàng)建并運行了CRISPR-Cas系統(tǒng)，是第一個在人體細胞中使用CRISPR-Cas的人。這早于Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier的專利申請的提交時間，甚至也早于她們在Science上發(fā)布自己的研究成果的時間。Jennifer Doudna在她早期專利申請中的預(yù)測CRISPR將會對人類細胞有用只是一種泛泛的猜想，而張鋒是第一個證明CRISPR驚人作用的人。

CRISPR技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

CRISPR該技術(shù)為生命科學(xué)帶來了革命性影響，有可能使治愈遺傳性疾病變成現(xiàn)實，正在為治療腫瘤的新方法做出貢獻。

1 利用CRISPR技術(shù)可以建立腫瘤的動物模型

傳統(tǒng)制作小鼠模型的方法是在小鼠胚胎干細胞中引入突變，然后將干細胞注射到胚囊中形成嵌合體小鼠，再經(jīng)過一代才能獲得純合突變的小鼠。CRISPR/Cas9技術(shù)有效地提高了制作小鼠模型的效率。

染色體重排是很多腫瘤發(fā)生的原因。運用傳統(tǒng)的方法制作染色體重排的癌癥模型，需要在兩個重排位點加上loxP序列，通過Cre-loxP重組制作染色體重排。運用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生染色體重排非常簡單，只需要靶向切割兩個重排位點就可以了。比如人類2號染色體重排會導(dǎo)致EML4-ALK融合表達，引發(fā)非小細胞肺癌，用CRISPR/Cas9建立EML4-ALK融合基因肺癌小鼠模型就容易得多。

2 找到腫瘤的致病或轉(zhuǎn)移的基因

很多情況下腫瘤是多個基因突變協(xié)同作用的結(jié)果，如何找出引發(fā)癌癥的關(guān)鍵突變是個難題。張鋒團隊運用CRISPR/Cas9文庫對一個不具備轉(zhuǎn)移能力的肺癌細胞系進行了高通量的單基因隨機敲除，然后移植到免疫缺陷的小鼠中，其中一些細胞離開了原有的位置隨著血管遷移形成了高轉(zhuǎn)移性的腫瘤;通過對轉(zhuǎn)移性腫瘤的sgRNA測序，篩查到了與腫瘤生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個基因以及mRNA。

3 用于腫瘤治療

CRISPR/Cas9在治療癌癥上有幾種應(yīng)用的可能：直接攻擊癌細胞中的關(guān)鍵基因;用于編輯免疫細胞，通過免疫細胞攻擊腫瘤細胞。在NIH臨床試驗注冊官網(wǎng)http://www.網(wǎng)站上搜索CRISPR，有不少項與CRISPR/Cas9相關(guān)的臨床試驗，其中24項與腫瘤治療相關(guān)。值得一提的是，我國四川大學(xué)華西醫(yī)院的盧鈾教授團隊開展了全球第一例應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)的治療肺癌的人體臨床試驗。

CRISPR/Cas9在最近很火的CAR-T療法和免疫檢查點療法(PD-1/L1)中有很多的應(yīng)用。CRISPR/Cas9技術(shù)可以提高CAR-T細胞的制備效率，CAR-T療法通過采集患者的T細胞進行基因修飾，成為CAR-T細胞后輸入患者體內(nèi)，過程用時長、難度高且成本大，還有T細胞自身的治療數(shù)量限制。而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)能明顯提高CAR-T細胞的制備效率，其對一個正常的免疫T細胞進行基因改造，在引入CAR序列時去除T細胞內(nèi)源性αβT細胞受體基因和人白細胞抗原 I(HLA I)類編碼基因，以防止用于不同患者時產(chǎn)生抗宿主反應(yīng)。

CRISPR技術(shù)可以提高CAR-T細胞的功能，CRISPR/Cas9技術(shù)可以通過敲除編碼信號分子的基因或T細胞抑制性受體的基因來提高CAR-T細胞的功能。CAR-T細胞療法的抗腫瘤療效顯著，但只能特異性識別腫瘤細胞表面受體，而腫瘤特異性T細胞受體(TCR-T)細胞能夠通過基因修飾表達特異性受體，識別腫瘤細胞表面經(jīng)Ⅰ類主要組織相容性抗原呈遞的抗原肽從而識別胞內(nèi)特異性分子。但受體T細胞中存在的內(nèi)源性TCR與修飾后的TCR可能會存在競爭反應(yīng)，因此采用CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)制備TCR、HLAⅠ類分子和PD-1缺失的CAR-T細胞，使其異體反應(yīng)降低又不引起抗宿主疾病，體內(nèi)抗腫瘤療效也得到提升。

CRISPR/Cas9在免疫檢查點藥物(PD-1/L1)中也有很多應(yīng)用，通過CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)敲除參與免疫負調(diào)節(jié)的基因，也能達到同樣的抗腫瘤效果，是一種全新的治療思路。利用電穿孔方法將Cas9和sgRNA導(dǎo)入T細胞并敲除PD-1基因，使其表達減少，長時間的體外培養(yǎng)過程中沒有發(fā)現(xiàn)PD-1對T細胞活化的影響，使T細胞更好地發(fā)揮其抗腫瘤療效。這種新的阻斷療法常常與過繼性T細胞免疫療法結(jié)合使用，可以增強免疫細胞的活性。

CAR-T領(lǐng)域的先驅(qū)Carl June教授發(fā)表研究證實，體外和動物模型研究中，用CIRSPR技術(shù)敲除TCR和B2M這兩個和免疫排除有關(guān)的基因后，T細胞同種異體反應(yīng)性降低，且未導(dǎo)致GVHD。

綜上，CRISPR/Cas9技術(shù)在腫瘤的診療和研究中有很多的應(yīng)用前景，該技術(shù)可能把腫瘤治療推進到一個新時代。但CRISPR/Cas9技術(shù)也有它的問題，比如脫靶的問題、倫理學(xué)的問題等。

(編撰 尹勇)