復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、柯愛武副研究員、蔡加彬博士領(lǐng)銜的研究團隊發(fā)現(xiàn)，對PD-1抑制劑有耐藥性的肝細胞癌(HCC)上調(diào)表達轉(zhuǎn)錄因子ZFP64，隨后ZFP64被蛋白磷酸化酶Cα(PKCα)活化，從而促進巨噬細胞集落刺激因子1(CSF1)表達;而CSF1又會招募并促進巨噬細胞極化為促癌的M2表型，導(dǎo)致HCC的免疫逃逸并對PD-1抑制劑產(chǎn)生耐藥。使用蛋白激酶抑制劑G?6976或侖伐替尼，可阻斷PKCα/ZFP64/CSF1軸，恢復(fù)HCC對PD-1抑制劑的敏感性。(J Hepatol. 2022年2月24日在線版 DOI: 10.1016/j.jhep.2022.02.019)

為了探討對PD-1抑制劑治療耐藥HCC的特征，研究者選取10例接受PD-1抑制劑治療后疾病進展、7例部分緩解的患者肝臟活檢樣本進行了NGS測序。分析發(fā)現(xiàn)，ZFP64在疾病進展患者腫瘤組織中顯著上調(diào)表達。在小鼠原位腫瘤模型中，若腫瘤細胞過表達ZFP64，則小鼠腫瘤生長更迅速，對PD-1抑制劑治療反應(yīng)更差。

在驗證隊列中，研究者發(fā)現(xiàn)ZFP64在腫瘤中顯著上調(diào)，且ZFP64表達與腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細胞的數(shù)量呈反比，ZFP64水平高與患者預(yù)后不良相關(guān)，提示ZFP64可能是引起HCC免疫逃逸以及PD-1抑制劑耐藥的關(guān)鍵因素。

為了在體內(nèi)環(huán)境探究ZFP64對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，研究者使用一種能自發(fā)肝細胞癌的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。實驗結(jié)果顯示，若使小鼠肝細胞過表達ZFP64，則HCC發(fā)生率、生長速度、轉(zhuǎn)移率均顯著增加。

對腫瘤微環(huán)境進行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤中巨噬細胞明顯增多，主要是促癌的M2巨噬細胞;CD4+T以及CD8+T細胞顯著減少。說明ZFP64可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且誘導(dǎo)形成免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境。

研究者將巨噬細胞與ZFP64hi HCC細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這可促使巨噬細胞上調(diào)表達CD206、CD163和Arg1等M2巨噬細胞的標(biāo)志物，同時還上調(diào)表達免疫抑制細胞因子IL-10和TGF-β1;共培養(yǎng)后的巨噬細胞可強烈地抑制T細胞增殖與活化。趨化實驗還發(fā)現(xiàn)ZFP64hi HCC促進巨噬細胞的趨化募集，提示ZFP64hi HCC可通過誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化和促進巨噬細胞趨化募集兩種機制，增加腫瘤內(nèi)M2巨噬細胞數(shù)量。

因ZFP64是一種轉(zhuǎn)錄因子，或是它調(diào)控了某種重要基因表達，以此調(diào)控巨噬細胞。為證實這一猜測，研究者通過RNA測序及ChIP-seq技術(shù)結(jié)合細胞系實驗，尋找ZFP64的靶基因，最終發(fā)現(xiàn)ZFP64可促進CSF1的轉(zhuǎn)錄激活。

研究者通過共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，敲低腫瘤細胞的CSF1后，巨噬細胞的Arg1、IL-10和TGF-β1表達水平顯著降低，且趨化運動也減少，提示ZFP64通過激活CSF1的轉(zhuǎn)錄，從而促進巨噬細胞的招募與M2極化。

研究者探究了ZFP64活性的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)PKCα可磷酸化ZFP64第226位絲氨酸，從而促進ZFP64核定位與轉(zhuǎn)錄激活能力，PKCα、ZFP64和CSF1組成了一個完整的免疫逃逸信號軸。對臨床隊列的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者PKCα/ZFP64/CSF1軸的激活與不良預(yù)后相關(guān)，且與PD-1抑制劑治療效果呈現(xiàn)負相關(guān)。

研究者嘗試使用PKCα抑制劑G?6976抑制這條信號軸發(fā)現(xiàn)，G?6976單藥治療就可抑制腫瘤生長，并改善腫瘤免疫微環(huán)境。若將G?6976與PD-1抑制劑聯(lián)用，則可取得更好療效。更重要的是，研究者發(fā)現(xiàn)使用已獲批的多激酶抑制劑侖伐替尼與PD-1抑制劑聯(lián)用，也能顯著改善治療效果。

既然CSF1是PKCα/ZFP64/CSF1軸的最終效應(yīng)因子，那么抑制CSF1信號是否能發(fā)揮很好的效果?為了探討這一可能性，研究者使用CSF1R抑制劑BLZ945對荷瘤小鼠進行治療，發(fā)現(xiàn)單用BLZ945就能很好地抑制腫瘤生長，若將其與PD-1抑制劑聯(lián)用，則可極大地改善PD-1抑制劑的療效。

該研究揭示了在HCC中一種前所未知的PD-1抑制劑耐藥機制，為預(yù)測PD-1抑制劑療效提供了指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)使用已獲批的侖伐替尼與PD-1抑制劑聯(lián)合使用可克服耐藥提高療效，有非常重要的臨床參考價值。(編譯 胡靜)