西湖大學(xué)謝琦等，基于計算蛋白質(zhì)設(shè)計的方法從頭設(shè)計并篩選得到了針對膠質(zhì)母細胞瘤表面的高表達的腫瘤抗原EGFR和CD276兩個靶點高親和力的迷你結(jié)合蛋白（Binder）CAR結(jié)構(gòu)，同現(xiàn)階段臨床試驗中的相同靶點的scFv CAR結(jié)構(gòu)相比較，在臨床前模型中Binder CAR顯著提高了CAR T療法對于膠質(zhì)母細胞瘤的治療效果。（Nat Biomed Eng. 2024年10月17日在線版）

CAR-T是新型腫瘤免疫療法，通過基因工程改造患者T細胞，利用CAR結(jié)構(gòu)的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別腫瘤細胞表面抗原并通過胞內(nèi)信號域激活T細胞，有效地識別并攻擊腫瘤細胞。CAR在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療領(lǐng)域已取得巨大成功，國內(nèi)外已有多款針對血液腫瘤的CAR T藥物上市。

CAR T療法對包括膠質(zhì)母細胞瘤在內(nèi)的諸多實體瘤效果卻十分有限。為進一步提升CAR T細胞在治療實體瘤時的療效，當(dāng)前多數(shù)研究致力于改良CAR T細胞內(nèi)的共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或通過基因編輯系統(tǒng)重編程細胞狀態(tài)，以達到提升其治療實體瘤時的療效的目的。

作為腫瘤細胞特異性識別的核心部件，CAR T細胞的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，基本上沿用初代CAR T采用單鏈抗體的設(shè)計。然而，scFv由單克隆抗體的輕鏈（VL）和重鏈（VH）通過Linker連接而成，因此單鏈抗體的重、輕鏈易發(fā)生錯誤聚集和折疊，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，不僅影響了T細胞識別抗原細胞能力，還可引起非抗原依賴性的T細胞激活，導(dǎo)致T細胞的過早耗竭，極大降低了CAR-T療法治療效果。開發(fā)不依賴于傳統(tǒng)單鏈抗體的CAR T抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新策略，可能為提高CAR T細胞治療實體瘤療效開辟蹊徑。

研究者開發(fā)了一套使用Binder代替?zhèn)鹘y(tǒng)scFv作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新型CAR構(gòu)建策略，用于有效識別腫瘤表面抗原，并提高CAR T療法對于膠質(zhì)母細胞瘤的治療效果。該策略從已知癌癥靶標的蛋白結(jié)構(gòu)入手，選擇合適的靶蛋白表面，并利用游離氨基酸匹配和空間匹配算法獲得與該表面契合的Binder空間位置，使用Rosetta平臺，通過能量打分函數(shù)對Binder的氨基酸序列進行設(shè)計，并進行多輪迭代優(yōu)化，得到了對于腫瘤靶標具有良好的穩(wěn)定性和良好的識別結(jié)合能力的Binder蛋白（約55~60個氨基酸）。再將優(yōu)化完成的Binder蛋白與二代CAR結(jié)構(gòu)進行組裝，并在體內(nèi)體外多層次驗證其生物學(xué)功能。

研究者首先從已報道的EGFR binder入手，用于驗證Binder CAR T該項設(shè)計的可行性。他們嘗試將EGFR binder整合入具有4-1BB或是CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的二代CAR結(jié)構(gòu)中，同時采用現(xiàn)階段臨床試驗進行中的相同靶點的EGFR scFv結(jié)構(gòu)也用相似的策略構(gòu)建產(chǎn)生scFv CAR作為實驗對照。

研究者對Binder CAR T的性質(zhì)進行了系統(tǒng)性的功能分析，包括在CAR T細胞在體外與膠質(zhì)母細胞瘤干細胞或膠質(zhì)母細胞瘤原代腫瘤細胞的體外共培養(yǎng)體系中評估Binder CAR T與傳統(tǒng)scFv CAR T腫瘤殺傷，細胞增殖、細胞毒性細胞因子分泌和T細胞耗竭以及轉(zhuǎn)錄組水平變化等多個指標。

實驗結(jié)果顯示，EGFR binder CAR T細胞在所有這些方面的表現(xiàn)都明顯優(yōu)于EGFR scFv CAR T細胞，其在面對高負荷的腫瘤壓力的情況下，Binder CAR T維持了更高的腫瘤殺傷能力，更高的細胞因子分泌水平以及較強的細胞增殖能力，并且在腫瘤負荷下表現(xiàn)出較低的腫瘤耗竭指標的表達。

而在小鼠原位膠質(zhì)母細胞瘤異種移植模型以及免疫健全小鼠模型中，EGFR binder CAR T細胞相較于傳統(tǒng)EGFR scFv抑制了腫瘤生長，顯著延長了小鼠的存活時間，顯示卓越的抗腫瘤功效，且無明顯的毒副作用。

為進一步驗證Binder CAR T設(shè)計策略的是否具備有廣譜的適用性，研究者沿用相同策略，從頭設(shè)計了一種專門針對另一種膠質(zhì)母細胞瘤抗原CD276的binder CAR T。與CD276 scFv CAR T細胞相比，工程改造的CD276 binder CAR T細胞也在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出卓越的腫瘤殺傷能力，這表明Binder CAR T策略對不同靶點均具有可行性。

該研究開發(fā)了基于蛋白質(zhì)從頭設(shè)計技術(shù)的Binder蛋白替代傳統(tǒng)的scFv作為CAR T抗原結(jié)合域的新策略，在臨床前模型中展示出了優(yōu)異的抗腫瘤效果?；诖耍谖骱髮W(xué)和西湖實驗室的大力支持下，研究者和臨床醫(yī)院合作，正在開展基于CD276 binder CAR T治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤的研究者發(fā)起的臨床試驗，有望為膠質(zhì)母細胞瘤的治療提供新助力。

（編譯 張俊熙）