由國(guó)家肝癌科學(xué)中心王紅陽(yáng)院士和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院侯金林教授牽頭開展的一項(xiàng)HCC早篩研究顯示，基于游離DNA(cfDNA)的HIFI(5-Hydroxymethylcytosine/motIf/Fragmentation/nucleosome footprInt)方法在鑒別HCC和非HCC人群上具有高度準(zhǔn)確性，可作為HCC早期診斷和篩查的新策略。(Cell Res. 2021年2月15日在線版 doi: 10.1038/s41422-020-00457-7)

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)死亡率位居第二位的惡性腫瘤，對(duì)于HCC的早期診斷可以提供手術(shù)等根治性治療的機(jī)會(huì)而改善預(yù)后。肝硬化可使每年HCC發(fā)病率升高2%~4%，肝硬化發(fā)展為HCC涉及一些基因或表觀遺傳改變。由于目前診斷方法準(zhǔn)確性有限，亟需在肝硬化患者中探索新型非侵入性策略來進(jìn)行HCC的早期診斷。

研究者從中國(guó)11個(gè)省的13家醫(yī)院收集2250例肝硬化患者、508例HCC患者和476例健康對(duì)照者(CTRL)的cfDNA，隨機(jī)分為訓(xùn)練、驗(yàn)證和檢驗(yàn)隊(duì)列以建立和評(píng)估診斷模型。使用最先進(jìn)的二代測(cè)序(NGS)獲得全基因組cfDNA的5-羥甲基胞嘧啶(5-hmc)，核小體印跡(NF)，5'端末端序列和片段特征。

研究最終納入3204例患者，發(fā)現(xiàn)HCC和CTRL患者具有不同的5-hmc修飾表現(xiàn)。NF分析顯示差異基因的檢測(cè)覆蓋具有足夠鑒別HCC和CTRL的效力。256個(gè)末端序列特征也是潛在的區(qū)分HCC和CTRL的參數(shù)。HCC cfDNA片段大小的變異性更大，片段更短(中位長(zhǎng)度<150 bp)?？傮w而言，所有4個(gè)特征顯示良好的診斷潛力。

整合上述4個(gè)基因組特征的HIFI方法鑒別HCC和肝硬化具有很高的診斷價(jià)值，在驗(yàn)證隊(duì)列中(95例HCC，100例肝硬化)對(duì)HCC的診斷敏感性達(dá)95.79%，特異性達(dá)95.00%，在檢驗(yàn)隊(duì)列中(148例HCC，1800例肝硬化)敏感性達(dá)95.42%，特異性達(dá)97.83%。

HIFI方法鑒別HCC和肝硬化的效力(驗(yàn)證隊(duì)列，AUC=0.995;檢驗(yàn)隊(duì)列，AUC=0.996)優(yōu)于甲胎蛋白(AFP，驗(yàn)證隊(duì)列，AUC=0.845;檢驗(yàn)隊(duì)列，AUC=0.826)。此外，HIFI方法在鑒別HCC和非HCC(肝硬化+CTRL)及CTRL上均具有良好的診斷表現(xiàn)。

不論是驗(yàn)證隊(duì)列(AUC=0.971)還是檢驗(yàn)隊(duì)列(AUC=0.973)，NF均為鑒別HCC和肝硬化最好的診斷特征。此外，其他3個(gè)基因特征也比AFP表現(xiàn)更佳(驗(yàn)證隊(duì)列，AUC=0.845;檢驗(yàn)隊(duì)列，AUC=0.826)。HIFI方法優(yōu)于其他基因特征的診斷效力也體現(xiàn)在鑒別HCC和非HCC或CTRL上。

為了獲得最佳模型，研究者評(píng)估了基因特征不同組的診斷效力，結(jié)果顯示HIFI優(yōu)于任何其他基因特征組合。此外，HIFI方法在5-hmc誤診的病例中也具有更高的準(zhǔn)確性。此前的研究顯示32個(gè)5-hmc標(biāo)志物的診斷評(píng)分具有良好的HCC診斷效力，而在驗(yàn)證隊(duì)列和檢驗(yàn)隊(duì)列中的評(píng)估顯示5-hmc的診斷準(zhǔn)確性劣于HIFI評(píng)分。

cfDNA濃度在不同個(gè)體中差別很大，HCC組最高。為了檢驗(yàn)臨床中應(yīng)用的可行性，在HCC/ 肝硬化樣本中重復(fù)評(píng)估了不同DNA輸入量和不同批次5-hmc測(cè)序/全基因組測(cè)序(WGS)數(shù)據(jù)的一致性，發(fā)現(xiàn)具有高度一致性，提示5-hmc測(cè)序/低通量WGS用于臨床的可行性。此外，盡管肝硬化患者片段大小顯著更長(zhǎng)，cfDNA濃度更低(<10 ng/mL)，但HIFI方法的診斷表現(xiàn)不受cfDNA濃度影響。

研究者還分析了地理分布偏倚，發(fā)現(xiàn)4個(gè)特征在11個(gè)省的樣本中穩(wěn)定且表現(xiàn)良好，而HIFI具有更好的準(zhǔn)確性。HIFI評(píng)分從CTRL到HCC患者具有逐漸升高的趨勢(shì)。肝硬化隊(duì)列中，有或無腹水的患者HIFI評(píng)分具有顯著性差異。HIFI與Child-Pugh評(píng)分、總膽紅素水平、白蛋白水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而與血小板水平正相關(guān)。在HCC隊(duì)列中，腫瘤體積更大(>5 cm)和更高的PIVKA-Ⅱ水平具有顯著更高的HIFI評(píng)分。伴有肝硬化史的HCC患者HIFI評(píng)分更高。

在肝硬化患者亞組中評(píng)估HIFI方法的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，HIFI方法在易于被誤診為HCC的AFP陽(yáng)性患者中具有更高的準(zhǔn)確性。HIFI方法也能準(zhǔn)確鑒別AFP陰性HCC和肝硬化。此外，無論年齡、Child-Pugh分類和HBV感染狀態(tài)，HIFI方法比AFP具有一致且更高的準(zhǔn)確性。但是HIFI的準(zhǔn)確性在伴有糖尿病和高血壓的肝硬化患者中輕微下降。

在HCC中，HIFI方法在AFP陰性和PIVKA-Ⅱ陰性患者中都具有高診斷準(zhǔn)確性。更重要的是，HIFI方法在發(fā)現(xiàn)早期HCC和極早期HCC極具效力，AFP/PIVKA-Ⅱ的早期HCC診斷準(zhǔn)確性大大低于HIFI方法。聯(lián)合AFP/PIVKA-Ⅱ和HIFI不能改善診斷準(zhǔn)確性。HIFI方法在診斷小HCC(直徑<3 cm，96.7%)上具有良好表現(xiàn)，而AFP和PIVKA-Ⅱ和腫瘤大小正相關(guān)。在AFP/PIVKA-Ⅱ誤診HCC病例中，HIFI達(dá)到很高的準(zhǔn)確性(93.9%/90.9%)。

人類基因組的5-hmc修飾影響基因表達(dá)活性，而NF反映了轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)多種5-hmc和NF標(biāo)志物在HCC中強(qiáng)烈富集。其他兩個(gè)片段標(biāo)志物，末段序列和片段大小攜帶了組織來源信息，它們?cè)贖CC生成中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

該研究基于cfDNA獨(dú)特的基因組特征開展了大規(guī)模、多中心研究，建立了診斷HCC的新型整合方法。HIFI方法在鑒別HCC和肝硬化及CTRL中具有高度準(zhǔn)確性，可以作為HCC早期診斷和篩查的新策略，有望滿足發(fā)現(xiàn)早期HCC的迫切需求。

研究尚存在一些局限性，例如隊(duì)列的患者均來自于中國(guó)，由于研究的主要目的是鑒別HCC和肝硬化，CTRL數(shù)量較小。但是考慮到其高度準(zhǔn)確性、非侵入性和通用性，HIFI方法在高危人群的公共衛(wèi)生篩查中具有極大的潛在價(jià)值。

(編譯 王鈺)