中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院龔暢教授和李雋教授領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，從曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌患者樣本中，篩選出關(guān)鍵的環(huán)狀RNA CDYL2(cirCDYL2)，揭示了cirCDYL2-GRB7-FAK通路促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥的原理。研究彌補(bǔ)了臨床預(yù)測曲妥珠單抗療效和耐藥的生物學(xué)指標(biāo)空白，為逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥提供了治療思路。(Mol Cancer. 2022, 21: 8. DOI: 10.1186/s12943-021-01476-7)

已有諸多研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA能調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，在包括乳腺癌的惡性腫瘤耐藥中扮演關(guān)鍵角色。龔暢教授團(tuán)隊(duì)利用高通量測序技術(shù)，從對曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌患者的腫瘤樣本中，篩選出特異性高表達(dá)的環(huán)狀RNA分子cirCDYL2。

通過分析127個(gè)接受過曲妥珠單抗治療的HER2陽性早期乳腺癌患者的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)cirCDYL2的乳腺癌腫瘤，腫瘤的尺寸更大，淋巴轉(zhuǎn)移能力和增殖能力更強(qiáng)，復(fù)發(fā)率更高，患者無病生存期及總生存期更短。cirCDYL2高表達(dá)的腫瘤中，Ki67(腫瘤增殖相關(guān)蛋白)表達(dá)，磷酸化AKT(P-AKT)和磷酸化ERK(P-ERK)的量更高，研究者推測cirCDYL2與HER2陽性乳腺癌患者對曲妥珠單抗耐藥有關(guān)。

研究者用HER2陽性乳腺癌患者的癌細(xì)胞構(gòu)建了人源腫瘤異種移植模型(PDX)，通過連續(xù)4周瘤內(nèi)注射小干擾RNA阻止cirCDYL2發(fā)揮作用(沉默)，發(fā)現(xiàn)cirCDYL2被沉默的實(shí)驗(yàn)組對曲妥珠單抗更敏感，腫瘤中的Ki67、P-AKT和P-ERK表達(dá)量都顯著下降。

研究者構(gòu)建了兩個(gè)曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3和BT474。發(fā)現(xiàn)沉默cirCDYL2后，雖不影響兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系的凋亡，但腫瘤細(xì)胞的活力、遷移能力、形成克隆的能力均減弱。cirCDYL2的表達(dá)量下調(diào)也導(dǎo)致磷酸化AKT和ERK1/2的表達(dá)量下調(diào)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)cirCDYL2的變化并不影響HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞增殖。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明cirCDYL2與HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的曲妥珠單抗耐藥有關(guān)。

研究者發(fā)現(xiàn)HER2與cirCDYL2之間沒有直接的調(diào)控關(guān)系，其中一個(gè)分子的表達(dá)量變化，不會直接影響另一個(gè)分子，推測cirCDYL2應(yīng)該跟HER2相關(guān)的信號通路蛋白有相互作用。

通過蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、環(huán)狀RNA拉下實(shí)驗(yàn)、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者終于確定cirCDYL2與GRB7信號蛋白存在相互作用。cirCDYL2是通過GRB7蛋白去促進(jìn)HER2+乳腺癌細(xì)胞的曲妥珠單抗耐藥。

進(jìn)一步分析這兩個(gè)分子之間的相互作用，研究者發(fā)現(xiàn)cirCDYL2使GRB7蛋白變得穩(wěn)定，但敲除cirCDYL2對GRB7的mRNA表達(dá)水平無顯著影響。研究者判斷cirCDYL2對GRB7的作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄翻譯之后。

之前研究已發(fā)現(xiàn)，GRB7可通過泛素化完成降解，研究者猜想cirCDYL2能影響GRB7的泛素化水平。研究者發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞內(nèi)的Pin1蛋白基因(GRB7的穩(wěn)定性的調(diào)控蛋白)敲除，可增加GRB7蛋白的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)染Pin1會提升GRB7蛋白泛素化水平。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)cirCDYL2可以在過表達(dá)Pin1的細(xì)胞環(huán)境下，提升GRB7蛋白穩(wěn)定性，相比僅過表達(dá)Pin1的細(xì)胞，同時(shí)過表達(dá)cirCDYL2和Pin1的細(xì)胞有更多GRB7蛋白可被沉淀下來。cirCDYL2是通過干預(yù)Pin1蛋白來抑制GRB7的泛素化降解，導(dǎo)致GRB7表達(dá)量上調(diào)。

研究者們利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK蛋白與circCDYL2存在相互作用。且相比對照組，過表達(dá)cirCDYL2的細(xì)胞中，能發(fā)現(xiàn)更多FAK與GRB7蛋白結(jié)合的現(xiàn)象，即circCDYL2可促進(jìn)GRB7與FAK結(jié)合。將FAK沉默后，對曲妥珠單抗耐藥的細(xì)胞中P-AKT和P-ERK變少，意味著耐藥性減弱。說明cirCDYL2是通過FAK來促進(jìn)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥。

研究者為在體內(nèi)證明HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗耐藥確實(shí)與cirCDYL2-GRB7-FAK的作用機(jī)制有關(guān)，將SK-BR-3細(xì)胞改造成過表達(dá)cirCDYL2的P-SK-BR-3細(xì)胞和敲除cirCDYL2的SK-BR-3-R細(xì)胞，并原位注射到小鼠乳房脂肪墊，實(shí)驗(yàn)組小鼠一周注射兩次曲妥珠單抗，44天后將腫瘤取出觀察結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅敲除cirCDYL2或者注射曲妥珠單抗這兩種手段對已經(jīng)耐藥的腫瘤生長無明顯影響，但在敲除cirCDYL2且注射曲妥珠單抗的實(shí)驗(yàn)組，腫瘤生長被顯著抑制。這說明敲除cirCDYL2可以逆轉(zhuǎn)腫瘤對曲妥珠單抗的耐藥。

使用FAK或者GRB7蛋白抑制劑干預(yù)，也可以達(dá)到敲除cirCDYL2類似的效果。即使是過表達(dá)cirCDYL2的腫瘤，使用FAK或者GRB7蛋白抑制劑也可以緩解曲妥珠單抗耐藥。cirCDYL2確實(shí)促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥，F(xiàn)AK及GRB7蛋白抑制劑可緩解曲妥珠單抗耐藥。

該研究揭示了cirCDYL2-GRB7-FAK通路在維持HER2表達(dá)中的關(guān)鍵作用，及其參與曲妥珠單抗耐藥的機(jī)理。同時(shí)證實(shí)cirCDYL2可以作為曲妥珠單抗耐藥、HER2陽性乳腺癌患者的潛在的標(biāo)志物，彌補(bǔ)了臨床預(yù)測曲妥珠單抗療效和耐藥的生物學(xué)指標(biāo)空白，進(jìn)而優(yōu)化患者臨床治療方案。FAK或GRB7抑制劑、cirCDYL2沉默或可成為逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥的治療思路。 (編譯 于娜)