天津腫瘤醫(yī)院 史振東 張瑾

乳腺癌是目前女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示：全球大約有170萬婦女被診斷為乳腺癌，死于該病的患者大約有52萬人;而預(yù)計(jì)到2050年，乳腺癌新增患者數(shù)據(jù)將達(dá)320萬，乳腺癌已成為當(dāng)今社會(huì)的重大公共健康問題。三陰性乳腺癌約占全部乳腺癌總數(shù)的10%~20%，多發(fā)生于年輕女性。相比于其他類型的乳腺癌，具有腫瘤體積大、病理等級(jí)高、淋巴結(jié)更易受累、侵襲性及轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)等特點(diǎn)，并且由于其不表達(dá)激素受體及HER2，三陰性乳腺癌不能從內(nèi)分泌治療和針對(duì)HER2的靶向治療中獲益，患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且臨床預(yù)后較差。乳腺癌的進(jìn)展包括一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)事件，如腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、局部浸潤、血管生成、循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的生存及遠(yuǎn)處定殖進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移瘤。因而，了解乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將為其選擇有效的治療方式提供依據(jù)。

小RNA是一種長度約20個(gè)核苷酸的非編碼RNA，近年來被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。它通過結(jié)合到其靶點(diǎn)mRNA 3’端非編碼區(qū)域，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。目前有研究發(fā)現(xiàn)：在非小細(xì)胞肺癌中miR-340可通過靶向一系列p27的負(fù)調(diào)控因子抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡;此外，還可通過靶向CDK6、Cyclin-D1與Cyclin-D2抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長。在乳腺癌中，miR-340可通過抑制c-Met發(fā)揮抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)機(jī)制在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。多梳抑制復(fù)合物(Polycomb Repression Complex 2，PRC2)是一種表觀遺傳調(diào)控因子，主要由EZH2、EED、SUZ12和RbAp46/48四種核心蛋白組成，其中EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是PRC2復(fù)合物的關(guān)鍵催化亞基，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。它可通過誘導(dǎo)組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27me3)來沉默特定基因表達(dá)參與的一系列生物學(xué)過程，包括腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、干細(xì)胞特性維持等。此外，H3K27的三甲基化還可以通過招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)進(jìn)而參與DNA的甲基化發(fā)揮基因沉默作用。EZH2除了可以通過經(jīng)典的PRC2依賴方式參與轉(zhuǎn)錄抑制外，目前有研究證實(shí)它還能以非PRC2依賴方式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。作為一種癌基因，越來越多的研究已證實(shí)，EZH2的過表達(dá)或突變存在于包括乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中，并且其表達(dá)水平的升高與腫瘤的惡性程度及患者的不良預(yù)后存在顯著的正相關(guān)。

在此研究中，天津腫瘤醫(yī)院張瑾等首先利用熒光原位雜交(FISH)及免疫組化(IHC)分別檢測(cè)了62例乳腺癌組織及腫瘤旁組織中的miR-340和EZH2表達(dá)水平。結(jié)果顯示：在癌旁正常組織中，miR-340表達(dá)顯著高于癌組織，而EZH2在腫瘤組織中的表達(dá)水平較高。半定量分析發(fā)現(xiàn)，miR-340表達(dá)與EZH2具有一定的負(fù)相關(guān)性(r=-0.42，P<0.01)。隨后在細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于激素敏感型乳腺癌細(xì)胞(T47D和MCF-7)，在三陰性乳腺癌細(xì)胞系(Cal51/MDA-MB-231和MDA-MB-468)中，miR-340表達(dá)水平較低，而EZH2表達(dá)水平較高。后續(xù)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-340種子序列與EZH2 mRNAs的3’非編碼區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，而熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)了EZH2是miR-340的一個(gè)靶基因。

在體外，MTT及Colony形成實(shí)驗(yàn)表明：miR-340可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-340將腫瘤細(xì)胞抑制在了G0/G1期，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡;Transwell檢測(cè)表明miR-340抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力;同時(shí)，熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-340上調(diào)了EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平，而β-catenin的細(xì)胞核水平表達(dá)降低。此外，張瑾等還構(gòu)建了MDA-MB-231的乳腺癌原位荷瘤模型，分別利用miR-340及其無義序列進(jìn)行3周治療。結(jié)果顯示：與無義序列組相比，miR-340抑制了小鼠皮下腫瘤的生長，并且處死后獲得的瘤塊質(zhì)量也顯著低于無義序列組。研究者們又對(duì)獲得的小鼠組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化及熒光原位雜交檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-340組與無義序列組相比的miR-340表達(dá)水平上調(diào)，而EZH2、MMP9、Ki-67的表達(dá)水平降低。

為進(jìn)一步探討可能的分子機(jī)制，研究者們利用蛋白印跡法檢測(cè)了EZH2小分子抑制劑DZNep及miR-340 mimics轉(zhuǎn)染后相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：DZNep組及miR-340 mimics組中DNMT1、H3K27me3、β-catenin、p-STAT3表達(dá)水平均降低，與此同時(shí)，miR-21表達(dá)水平降低，miR-200a/b的表達(dá)水平上調(diào)。同時(shí)結(jié)合前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：靶向EZH2后，miR-340一方面下調(diào)了DNMT1及H3K27me3的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了miR-200a/b的表達(dá)沉默;另一方面，通過下調(diào)p-STAT3，抑制了miR-21的轉(zhuǎn)錄激活;miR-200a/b的表達(dá)上調(diào)及miR-21活性降低共同抑制了三陰性乳腺癌的進(jìn)展。最終，研究者們確立了三陰性乳腺癌中以EZH2為核心的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，為其靶向治療提供了可能的靶點(diǎn)。