美國費城兒童醫(yī)院的Yu等，通過snRNA、snATAC以及WGS測序解析化療對高危神經(jīng)母細胞瘤微環(huán)境的影響，分析了腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）對治療的應(yīng)答及其與腫瘤細胞的相互作用，鑒定出肝素結(jié)合性表皮生長因子（HB-EGF）為促進腫瘤增值與耐藥的關(guān)鍵分子，為研究神經(jīng)母細胞瘤耐藥的分子機制提供了參考。（Nat Genet. 2025, 57: 1142-1154.）

神經(jīng)母細胞瘤是一種源自神經(jīng)嵴細胞的兒童實體腫瘤，通常發(fā)生于5歲以下的兒童，在生物學(xué)上有高異質(zhì)性，不同類別往往提示不同預(yù)后。臨床上按風(fēng)險類別可將其劃分為低危、中危及高危三個等級，中低危神經(jīng)母細胞瘤通常有較好的預(yù)后，而高危神經(jīng)母細胞瘤具有高度侵襲性，現(xiàn)有治療手段的5年生存率仍低于50%。腫瘤微環(huán)境與異質(zhì)性獲得性耐藥或可解釋這些預(yù)后差異。

表觀遺傳學(xué)分析已鑒定出兩種不同的神經(jīng)母細胞瘤分子表型，腎上腺素樣（ADRN）及間質(zhì)樣（MES）。ADRN提示腫瘤細胞分化程度較高且對化療敏感，而MES則代表腫瘤低分化、易耐藥與易轉(zhuǎn)移。單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展有助于描述腫瘤細胞內(nèi)在的異質(zhì)性，并解析腫瘤微環(huán)境中的細胞互作關(guān)系，為理解腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及治療對微環(huán)境的重塑提供了新視角。然而，神經(jīng)母細胞瘤與其免疫表型間的作用關(guān)系及耐藥機制仍不清楚。

研究者選取了22例高危神經(jīng)母細胞瘤樣本，將來自同一患者的活檢樣本與誘導(dǎo)化療后手術(shù)切除的樣本配對，通過snRNA、snATAC和WGS進行分析，分別從snRNA-seq和snATAC-seq中獲得了372 619個和144 366個高質(zhì)量細胞，經(jīng)過注釋得到8種主要細胞群（神經(jīng)母細胞、成纖維細胞、Schwan細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T 細胞和 B 細胞），排除了3種組織特異性細胞群（肝細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞和腎細胞）。初步發(fā)現(xiàn)成纖維細胞及巨噬細胞在治療后的樣本中增加。

研究者分析了腫瘤細胞的狀態(tài)，以此解析腫瘤細胞內(nèi)在的異質(zhì)性。結(jié)合來自WGS 數(shù)據(jù)與snRNA-seq數(shù)據(jù)的拷貝數(shù)變異（CNV） 譜識別腫瘤細胞，共鑒定出205 253個腫瘤細胞。將這些腫瘤細胞重新整合聚類后，劃分出6種不同狀態(tài)的腫瘤細胞，從分子表型的角度注釋出4個ADRN高簇、1個MES高簇，以及1個兼具中等ADRN和MES特征的中等簇（Interm-OXPHOS）；ADRN高簇又可進一步劃分為ADRN-鈣、ADRN-多巴胺能、ADRN-基線與ADRN-增殖這些群體。

研究者評估了新定義的腫瘤細胞群體在治療期間的改變，發(fā)現(xiàn)ADRN-基線和ADRN-增殖群體在治療后降低，而ADRN-鈣、ADRN-多巴胺能和Interm-OXPHOS群體在治療后增加。ALK突變患者的ADRN-基線和ADRN-增殖群體的減少幅度明顯較小，治療后MES狀態(tài)明顯下降，提示攜帶突變的高?；颊吲c其他高?；颊卟煌哪[瘤特征。最后結(jié)合臨床信息評估了新定義的細胞狀態(tài)的臨床意義。

在定義了腫瘤細胞特征狀態(tài)后，研究者使用snATAC-seq數(shù)據(jù)進一步探究了這些細胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，鑒定出11個表觀遺傳簇并構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，AP-1（activator protein-1）編碼基因及其靶標在治療后上調(diào)，提示治療后MES表型上調(diào)。ADRN-增殖這一臨床不利的群體在治療后減少，但表征其狀態(tài)的基因仍保持表型，初步解釋了神經(jīng)母細胞瘤難治性及耐藥性的可能機制。

為進一步分析高危神經(jīng)母細胞瘤的耐藥機制，研究者對TAM這一在微環(huán)境中最豐富的免疫成分進行了分析。通過對來自snRNA-seq的TAM數(shù)據(jù)的整合聚類，劃分出8個TAM亞群，基于細胞狀態(tài)鑒定出7種不同的細胞群（增殖、促炎、促血管生成、免疫抑制、組織駐留、脂質(zhì)相關(guān)及未定義狀態(tài)），并在治療前后的樣本中觀察到這些細胞狀態(tài)的顯著變化。其中僅有IL-18+促炎狀態(tài)群體在治療后減少，提示IL-18+巨噬細胞可能與更好的預(yù)后相關(guān)。

研究者使用CytoTalk對TAM與腫瘤細胞的相互作用進行了分析，預(yù)測了二者之間的配體-受體相互作用。結(jié)果顯示這些相互作用涉及促進細胞黏附、細胞遷移及血管生成的分子，其中表皮生長因子家族（ErbB）受體（ERBB4和EGFR）與多種配體之間的相互作用最為常見。對這些相互作用的驗證則使用了38種抗體組對石蠟包埋樣本的索引（CODEX） 空間蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測，從中鑒別出3種腎上腺素能神經(jīng)母細胞亞群，ISL1 高群體（ADRN-like-1）、PPP2R2C高群體（ADRN-like-2）和PHOX2B表達最低的群體 （ADRN-like-3）。

研究者發(fā)現(xiàn)，ERBB4受體在ADRN-like-2神經(jīng)母細胞中呈現(xiàn)高表達，ERBB4配體HB-EGF和TGFA在ADRN-like-2神經(jīng)母細胞周圍呈現(xiàn)高密度，且這一細胞群體在空間上更靠近巨噬細胞，提示巨噬細胞誘導(dǎo)的ErbB信號傳導(dǎo)可能為促進腎上腺素能腫瘤細胞增殖的潛在機制。

研究者構(gòu)建了小鼠神經(jīng)母細胞瘤模型，并使用Xenium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對腫瘤進行檢測，在體內(nèi)水平進一步探究了TAM與腫瘤細胞的相互作用關(guān)系。在小鼠模型上驗證了此前鑒定的多種細胞表型，并通過空間配體-受體分析驗證了預(yù)測的相互作用，初步證明了人類神經(jīng)母細胞瘤微環(huán)境的關(guān)鍵表型也存在于小鼠模型中。

基于得到驗證的配體-受體相互作用，研究者假設(shè)在ADRN腫瘤狀態(tài)下，TAM通過激活ErbB受體酪氨酸激酶導(dǎo)致細胞增殖及耐藥性，且由于HB-EGF在治療后普遍呈現(xiàn)高表達，研究者推斷HB-EGF與ErbB通路具有一定的協(xié)調(diào)作用。通過細胞實驗將5種神經(jīng)母細胞瘤細胞系與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)后得出，共培養(yǎng)使得THP-1巨噬細胞表達HB-EGF增加。對共培養(yǎng)的上清液進行ELIZA得出，THP-1巨噬細胞僅分泌HB-EGF配體，這一發(fā)現(xiàn)支持HB-EGF為活性配體。此外，共培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤細胞的ERBB4受體磷酸化顯著增加，提示HB-EGF/ERBB4信號可能介導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞與TAM的相互作用。

研究者使用3種神經(jīng)母細胞瘤細胞系進行共培養(yǎng)和單培養(yǎng)，確定共培養(yǎng)的巨噬細胞產(chǎn)生的HB-EGF激活了下游信號ERK，推測ErbB信號通過RAS–RAF–MEK–ERK通路調(diào)節(jié)細胞的活動，且ErbB通路有助于腫瘤細胞存活。為了評估TAM與腫瘤細胞的相互作用對腫瘤細胞表型的影響，研究者對共培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤細胞系進行了scRNA測序。結(jié)果顯示共培養(yǎng)后，腫瘤細胞發(fā)生的改變與經(jīng)歷標準治療后類似，而加入HB-EGF抑制劑CRM197后這一進程被改變。

該研究通過對患者匹配的高危神經(jīng)母細胞瘤樣本的單細胞多組學(xué)分析，揭示了誘導(dǎo)化療導(dǎo)致的腫瘤微環(huán)境變化。同時對腫瘤相關(guān)巨噬細胞這一群體進行深入研究，鑒定出與腫瘤細胞相互作用的關(guān)鍵分子及通路，并在體內(nèi)與體外層面對這一通路的真實性進行了驗證，初步證實了腫瘤細胞誘導(dǎo)巨噬細胞分泌HB-EGF，進而通過激活ERK通路促進神經(jīng)母細胞增殖，揭示了神經(jīng)母細胞瘤可能的耐藥機制，為后續(xù)研究提供了參考。 （編譯 張瑞軒）