2023年8月24日，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院柯楊課題組在Cell 子刊Cell Reports Medicine在線發(fā)表題為“Absence of Lugol staining indicates initiation of esophageal squamous cell carcinoma: a combined genomic and epidemiologic study”的研究報(bào)告。該研究依托課題組在食管癌高發(fā)區(qū)開展的大規(guī)模自然人群食管碘染內(nèi)鏡篩查試驗(yàn)隊(duì)列（“ESECC trial”，NCT01688908）¹，聯(lián)合基因組學(xué)和人群流行病學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了食管鱗狀上皮不同病變階段的基因組變異規(guī)律和發(fā)生癌變的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)，首次揭示食管黏膜的“碘不染色病變（Lugol unstaining lesions, LUL）”是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌化的起始階段，且發(fā)生時(shí)間早于傳統(tǒng)病理學(xué)層面的細(xì)胞形態(tài)改變。這一重要發(fā)現(xiàn)為認(rèn)識(shí)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的自然史以及食管癌精準(zhǔn)篩查策略的建立和優(yōu)化提供了重要科學(xué)依據(jù)。

食管癌是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一。中國(guó)食管癌新發(fā)和死亡病例數(shù)占全球半數(shù)以上。與西方國(guó)家以食管腺癌為主不同，中國(guó)的食管癌以鱗狀細(xì)胞癌為主。在主要病因尚未明確的情況下，開展人群水平的食管癌內(nèi)鏡篩查，通過早診早治降低食管癌死亡負(fù)擔(dān)，是當(dāng)前食管癌防控主要手段。碘染色內(nèi)鏡是食管癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)基于碘與食管上皮細(xì)胞內(nèi)糖原反應(yīng)，通過對(duì)碘不染色病變（Lugol unstaining lesion, LUL）進(jìn)行指示性活檢并聯(lián)合組織病理學(xué)診斷，實(shí)現(xiàn)對(duì)食管早期病變的診斷和臨床干預(yù)。

一直以來，病理學(xué)層面的鱗狀上皮異型增生被認(rèn)為是食管鱗狀上皮癌化過程的起始階段。內(nèi)鏡下的碘染色缺失一直僅被作為“早期病理學(xué)改變”的指示，其背后的基因組變異特征以及在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展自然史中的作用未被認(rèn)知。該項(xiàng)研究基于食管癌高發(fā)社區(qū)自然人群建立的專病篩查隊(duì)列，積累了具有良好人群代表性的早期病變樣本及長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)，系統(tǒng)探索了食管多階段病變的基因組變異規(guī)律及長(zhǎng)期腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，揭示了食管上皮癌化進(jìn)程的新階段及不同病變發(fā)生“時(shí)序”，為科學(xué)認(rèn)識(shí)食管鱗癌自然史及防治策略的優(yōu)化提供了新的關(guān)鍵證據(jù)。

該研究納入了來自ESECC人群內(nèi)鏡篩查的不同病變階段活檢組織樣本，包括26例正常食管上皮、24例病理診斷無(wú)異型增生但內(nèi)鏡下碘染缺失病變（ND-LUL）、30例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、26例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變以及57例食管鱗癌樣本。通過全外顯子組測(cè)序，該研究首先發(fā)現(xiàn)，隨著病變級(jí)別升高，體細(xì)胞突變負(fù)荷逐漸增加，且在ND-LUL階段即已出現(xiàn)顯著特異性突增，而在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及其后病變階段，突變負(fù)荷呈現(xiàn)穩(wěn)定累積態(tài)勢(shì)。

圖1 食管鱗狀上皮不同病變階段突變特征

（A-B）不同病變階段的突變數(shù)量及突變率；（C）不同病變階段的突變頻譜；（D）三種主要的突變印記；（E）主要突變印記的貢獻(xiàn)比例。

 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，各階段病變中均已存在食管癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變，且突變頻率隨病變級(jí)別增加逐漸升高。其中，TP53是最高頻突變基因，且在正常上皮中已有大量TP53基因突變存在。而與之相反，NOTCH1基因突變?cè)谡＝M織中廣泛存在，但隨著病變級(jí)別升高其突變頻率逐漸降低，這一結(jié)果支持了食管鱗癌起源于無(wú)NOTCH1克隆的假說²，也與該課題組前期發(fā)現(xiàn)NOTCH1突變水平降低可早期預(yù)警食管癌前病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)果一致³。

圖2 食管鱗狀上皮不同病變階段突變基因譜

拷貝數(shù)變異（Copy number variation）分析發(fā)現(xiàn)，與突變分析結(jié)果一致，相較于正常組織，ND-LUL階段即已發(fā)生拷貝數(shù)變異程度顯著升高，既往在食管癌及異型增生病變中常見的拷貝數(shù)變異區(qū)域在ND-LUL中亦被發(fā)現(xiàn)。在其后更高級(jí)別病變中，拷貝數(shù)變異程度亦呈現(xiàn)穩(wěn)定積累趨勢(shì)。

圖3 食管鱗狀上皮不同病變階段的拷貝數(shù)變異

（A）不同病變階段的拷貝數(shù)變異程度；（B）不同病變階段的平均拷貝數(shù)變異情況；（C）食管癌常見拷貝數(shù)變異區(qū)域的變異情況。

克隆擴(kuò)增分析顯示，與正常組織中較低的突變細(xì)胞比例相比，ND-LUL階段已出現(xiàn)明顯的克隆擴(kuò)增，且已達(dá)到與更高級(jí)別病變相似的程度。正向選擇基因篩選分析結(jié)果顯示，NOTCH1基因突變?cè)谡＝M織和突變細(xì)胞比例較低的ND-LUL中出現(xiàn)富集并具有較高的細(xì)胞比例，而隨著病變級(jí)別不斷升高，TP53逐漸成為多數(shù)樣本中具有最大突變細(xì)胞比例的基因。

圖4 食管鱗狀上皮不同病變階段突變細(xì)胞比例

（A）每個(gè)個(gè)體非沉默突變細(xì)胞比例；（B）每個(gè)個(gè)體最大細(xì)胞比例；（C）具有最大細(xì)胞比例的正向選擇基因占比。

進(jìn)一步按照內(nèi)鏡下碘不染區(qū)域大小對(duì)ND-LUL進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)變異負(fù)荷與病變大小呈現(xiàn)正相關(guān)。在較小病變（≤5mm）基因組變異程度與正常黏膜接近，但當(dāng)病變?cè)龃?/span>(>5mm)時(shí)，各維度變異程度迅速升高，提示碘不染色病變大小反映了突變累積和克隆擴(kuò)增的程度。

圖5 不同大小LUL中的基因組變異比較

（A）不同大小LUL中的體細(xì)胞突變率；（B）不同大小LUL中的拷貝數(shù)變異；（C）不同大小LUL中的突變細(xì)胞比例。

最后，該研究使用ESECC隊(duì)列長(zhǎng)達(dá)8年的隨訪數(shù)據(jù)，評(píng)估了不同大小和病理級(jí)別的碘不染病變進(jìn)展為食管癌的絕對(duì)和相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果顯示，對(duì)于病理診斷未見異常的ND-LUL組，當(dāng)?shù)獠蝗静∽冞_(dá)到6-10mm時(shí)，其進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)已顯著高于正常組，而當(dāng)病變達(dá)到10mm以上時(shí)，其進(jìn)展為食管癌的風(fēng)險(xiǎn)將發(fā)生數(shù)十倍級(jí)別的升高。這與該課題組前期發(fā)現(xiàn)的碘染異常特征（尤其是LUL大?。┡c病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的結(jié)果一致⁴。

圖6 基于ESECC人群8年隨訪數(shù)據(jù)評(píng)估不同LUL大小及病理級(jí)別亞組的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)

（A）基線篩查時(shí)不同LUL大小（1-5mm，6-10mm，>10mm）和不同病理級(jí)別對(duì)象進(jìn)展至癌的風(fēng)險(xiǎn)；（B）各亞組累積進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)曲線。

對(duì)食管鱗癌自然史認(rèn)知與篩查實(shí)踐的意義

該研究基于獨(dú)特的社區(qū)人群內(nèi)鏡篩查專病隊(duì)列所采集的不同級(jí)別病變食管黏膜樣本，聯(lián)合基因組學(xué)和長(zhǎng)期縱向隨訪數(shù)據(jù)，首次揭示在ND-LUL階段在突變、拷貝數(shù)變異及克隆擴(kuò)增等維度已發(fā)生大量基因組變異累積且遠(yuǎn)期癌變風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，其發(fā)生時(shí)間早于目前病理學(xué)可做出診斷的細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變?；诖?，研究者提出食管黏膜的碘染著色異常是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌化自然進(jìn)程的起始階段。這一發(fā)現(xiàn)重塑了人們對(duì)于食管鱗狀上皮細(xì)胞癌化自然史的傳統(tǒng)認(rèn)知，對(duì)建立更具效果和效率的食管癌防治干預(yù)窗口具有重要意義。

在當(dāng)前的篩查實(shí)踐中，針對(duì)內(nèi)鏡下所發(fā)現(xiàn)的碘不染色病變制定監(jiān)測(cè)和臨床處置策略僅依賴細(xì)胞學(xué)層面的組織病理診斷，即發(fā)現(xiàn)異型增生才推薦進(jìn)行內(nèi)鏡復(fù)查監(jiān)測(cè)和臨床處置。而未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異型化改變的ND-LUL患者在監(jiān)測(cè)中往往被忽視。研究者團(tuán)隊(duì)前期對(duì)于超千例碘不染色病變的隨訪觀察已證實(shí)，高達(dá)40%-50%最終進(jìn)展為食管癌的病例來自ND-LUL病變⁵。病理診斷的局限性使這部分患者未被現(xiàn)行監(jiān)測(cè)策略所覆蓋，從而失去被保護(hù)的機(jī)會(huì)。此項(xiàng)研究從分子遺傳學(xué)和流行病學(xué)層面解釋了內(nèi)鏡活檢聯(lián)合病理診斷對(duì)部分受檢者“無(wú)能為力”現(xiàn)象背后的深刻原因，再次強(qiáng)調(diào)了將ND-LUL病變納入篩查后內(nèi)鏡監(jiān)測(cè)的必要性，尤其是對(duì)于碘不染病變較大者更需關(guān)注。這為食管癌精準(zhǔn)篩查和監(jiān)測(cè)策略的建立以及揭示食管癌起源、發(fā)現(xiàn)新的早期預(yù)警分子標(biāo)志物提供了關(guān)鍵線索和科學(xué)基礎(chǔ)⁶。

該報(bào)告共同第一作者為北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院遺傳學(xué)研究室團(tuán)隊(duì)劉震助理研究員、劉萌飛副研究員、劉英副研究員、周仁博士及阿米爾·阿卜力孜講師（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院），通訊作者為團(tuán)隊(duì)聯(lián)合負(fù)責(zé)人柯楊教授、何忠虎研究員。

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原文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(23)00321-X